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人粒细胞无形体病实验室检测方案

发布时间:2016-7-13 10:28:06      浏览次数:

为保证及时、科学地采集、运送人粒细胞无形体病病例(包括疑似病例)及疫源地调查的各种类型标本,规范人粒细胞无形体病的实验室检测程序,提高检测质量,为明确诊断或开展相关的科学研究提供实验室依据,特制定本方案。

一、样本采集对象

(一) 人粒细胞无形体病病例(包括疑似病例,以下同)。

(二) 病例密切接触者或其他健康人群。

(三) 疫源地可疑宿主动物(野生动物及狗、羊、牛等家畜)、媒介蜱。

二、标本种类及采集方法

(一) 抗凝血。

常用EDTA抗凝管或枸橼酸盐抗凝管采集血液5ml,用于病原分离。应尽可能在病人使用抗生素前进行血液的采集。

(二)非抗凝血。

用无菌真空管,采集病例、健康人群及宿主动物非抗凝血5ml,用于血清抗体及PCR检测。采集后,应及时分离血清,将血清、血球分别保存。急性期抗体及PCR检测用血液采集尽可能在发病后1周内,恢复期抗体检测标本采集至少间隔2-3周。如第2份血清在1个月之内抗体升高不明显的,应建议间隔2-4周后采集第3份血液标本。

(三)包涵体检测血涂片的制备。

采集血液标本后,制作厚血片,进行红细胞裂解处理等。

(四)媒介蜱标本的采集。

采集动物体表媒介蜱,用镊子夹取,放入铺垫有潮湿滤纸或纱布的青霉素小瓶或试管中,用纱布包紧瓶口以防止蜱爬出。实验室接到蜱标本后,首先应进行种属鉴定,然后按类别分组(1-5只蜱/组),采用75%酒精浸泡30min后,用无菌蒸馏水反复冲洗3次。最后进行分组研磨,研磨液用于提取DNA,进行PCR扩增。

(五)有条件时,可采集活检或尸检标本,冰冻、福尔马林固定或石蜡包埋后进行实验室检测。具体方法参照病理实验室相关要求和卫生部《传染病人或疑似传染病人尸体解剖查验规定》的相关要求。

三、标本采集和保存注意事项

标本采集应符合无菌操作要求。抗凝血如不能立即床边接种,应置于4℃环境保存,避免冰冻(不超过2周)。非抗凝血应及时进行无菌分离血清,血清用于抗体检测,血球部分研磨后提取DNA用于PCR检测。如不能及时检测,可暂置于-20℃环境保存。所有标本应置入大小适合、带螺旋盖、内有垫圈的冻存管内,拧紧管口。

标本采集后,应认真填写采样登记表。

四、实验室检测

(一)包涵体的检测。

1. 血片及白细胞涂片制备

采集的抗凝血标本尽快用血球层推血片,待干燥后冷丙酮固定10min;或提取抗凝血中的白细胞并进行涂片,待干燥后冷丙酮固定10min

2. 染色

通常采用瑞氏(Wright)染色法、姬氏(Giemsa)染色法及瑞-姬混合染色法。有条件的实验室,可使用美国CDC推荐的染色方法。

3. 染液配置方法

1)瑞-姬染液:取瑞氏染料和姬氏染料各0.5 g,以甲醇研溶,加甲醇500ml保存,每天摇匀1次,1周后可使用。
   
2)改良Mc Donald法瑞-姬染色剂:75 ml甘油(分析纯)中加入磷酸盐缓冲液(Na2HPO4 1gKH2PO4 2g),以4 ml蒸馏水溶解,37 ℃水浴24 h溶解混匀,用滤纸过滤,保存于密封的棕色瓶中备用。上述甘油缓冲液1.5 ml加瑞-姬染色剂50 ml,混匀后备用。

4. 染色步骤

血推片或白细胞涂片分别以两种染色剂染色2 min,再加蒸馏水作用5 min,用自来水冲洗。
    5.
结果观察

中性粒细胞中可见桑葚状包涵体(见图1),并注意保存相关标本,以便进行复核。

(二)血清学检测。

常用血清学方法为间接免疫荧光(IFA)法。采集急性期(发热初期,一般发病1周内)与恢复期(至少间隔2-3周)双份血清。如恢复期血清抗体检测阴性,应建议医生采集第3份血液样本(间隔2-4周)。

1. 试剂 

使用国际推荐的、经过ISO质量认证的产品。

2. 方法及操作按说明书进行。

3. 结果解释

IFA检测结果解释按说明书进行。

如果同时检测双份血清,IgG抗体4倍升高,则结果强烈支持嗜吞噬细胞无形体感染。如果急性期抗体升高,而恢复期没有升高或轻微升高,则应采集第3份血液样本(间隔2-4周)进行进一步检测。

(三)嗜粒细胞无形体核酸PCR检测。

目前,国际推荐使用16S rRNA基因检测方法,有条件的实验室,可进一步选用热休克蛋白基因groEL扩增方法。

1. DNA提取

用急性期、未使用抗生素的EDTA抗凝血或非抗凝血血球部分、白细胞及蜱研磨液提取DNA。最后,以AE缓冲液50µl抽滤以提高回收的DNA浓度。如采用血液白细胞层提取DNA,可明显提高阳性检出率。实验时,应采集当地正常人血液同时提取DNA,作为PCR的阴性对照。

2. PCR扩增

116S rRNA基因检测:16S rRNA 高度保守,是PCR检测最常用的扩增靶基因,巢式PCR检测可提高检测灵敏度和特异度,采用属特异及种特异引物同时进行检测。PCR检测应分区进行,避免污染。使用引物序列见表1

巢式PCR检测无形体及埃立克体16S rRNA基因常用引物

引物名称

序 列

片段长度(bp)

Eh-out1(AF414399)

5’-TTG AGA GTT TGA TCC TGG CTC AGA ACG-3’

653

Eh-out2(AF414399)

5’-CAC CTC TAC ACT AGG AAT TCC GCT ATC-3’

Eh-gs1(AF414399)

5’-GTA ATA CT GTA TAA TCC CTG-3’

282

Eh-gs2(AF414399)

5’-GTA CCG TCA TTA TCT TCC CTA-3’

HGA1

5’-GTC GAA CGG ATT ATT CTT TAT AGC TTG -3’

389

HGA2

5’-TAT AGG TAC CGT CAT TAT CTT CCC TAC-3’

 

PCR反应混合物的准备按常规进行。第一轮反应采用外引物对Eh-out1Eh-out2DNA模板10µl(白细胞提取的DNA可适当减少)。PCR反应体系总体积为25µl或50µl(需要进行PCR测序或克隆时,应适当扩大反应体系),其它成分的浓度按常规进行。反应程序如下:

94℃  5min

40循环:94  45sec

        55℃  50sec

        72℃  1min

72℃  总延伸 5min

第二轮反应使用2对引物分别进行巢式PCR2对引物分别是无形体属及埃立克体属通用内引物(Eh-gs1Eh-gs2);以及HGA种特异性引物(HGA1HGA2)。检测样本取第一轮产物1-2µl为模板,阳性对照取0.5µl为模板。反应程序同第一轮反应。

2)热休克蛋白基因groEL扩增

groEL基因的应用相比,16S rRNA基因的应用更为广泛,但groEL基因在不同种属间具有较大的变异性。因此,对于诊断及菌株的鉴定,groEL基因均具有重要意义。该基因扩增使用巢式PCR,引物序列见表2

2  groEL基因扩增常用引物   

引物名称

 

退火温度

片段长度bp)

HS1

5’-TGG GCT GGT  AA/CTGA AAT

52

1431

HS6

5’-CCI CCI GGI ACI  AC/TACC TTC

HS43

5’-ATA/TGCA/T AAG/AGAA GCA TAG TC

55

HGA480

HS45

5’-ACT TCA CGC/T)(C/TTCA TAG AC

HME528

DNA提取同上。PCR检测时,反应混合物的准备按常规进行。DNA模板量同16S rRNA基因检测。巢式PCR第一轮反应采用外引物对HS1HS6

反应程序如下:

 3循环:94 1min

         48℃ 2min

         70℃ 90sec

37循环:88 1min

          52℃ 2min

          70℃ 90sec

 68℃ 总延伸 5min

第二轮PCR引物采用HS43HS45。检测样本取第一轮产物1-2µl为模板,阳性对照取0.5µl为模板。反应程序同第一轮反应。反应程序同第一轮反应,但退火温度由52℃改为55℃。

3.测序及分析

对扩增产物进行测序并进行同源比较,分析当地流行株与其它地区的变异性。

(四)病原体分离培养。

多用HL-60进行嗜吞噬细胞无形体的分离培养。最常用的分离方法是将白细胞部分接种培养基,然后将100-500µl抗凝血接种到悬浮有2×1051×106细胞内, 2-3天染色检查包涵体,一般5-10天可查见包涵体。由于分离可能受到红细胞的影响,因此,建议使用以下方法:

1.白细胞分离:采用密度梯度离心方法(Ficoll-Paque)。一般采用2-3 ml EDTA抗凝血,用2倍体积的无菌Hanks 平衡盐溶液稀释,最后采用HistopaqueSigmaSt . louis, Mo)密度梯度离心分离白细胞,可以获得较高的白细胞,用以分离HGA。采用白细胞分离方法进行接种时,应注意防止操作过程中的污染。

2. 红细胞裂解后收集白细胞(NHCl4裂解法)。

3. 在使用含有红细胞的标本培养后,另加入宿主未感染的细胞,建立混合培养。

血液白细胞悬浮于2ml体积、含有5-10%胎牛血清的培养基中,且在25 cm2培养瓶内与培养细胞作用3小时。37℃、5% CO2 条件下振摇孵育,可增加病原体与细胞的作用。

病原体的鉴定:可通过种特异引物进行PCR鉴定。

五、生物安全

在标本采集、运输及实验室工作过程中,生物安全应参照《病原微生物实验室生物安全管理条例》中的有关要求进行。

(一)实验室生物安全。

标本灭活、病原DNA标本提取及病原体分离操作应在生物安全Ⅱ级实验室进行。非感染性材料的检测可在生物安全I级实验室进行。

(二)血液标本采集安全注意事项。

采集病例的标本时,应做好个人防护。采集者应戴乳胶手套,尽量避免病例的血液外溢或直接接触。如发生血液外溢污染环境时,应及时采用75%酒精或常用消毒剂进行消毒处理。应按照对传染性样本的要求,对采集标本的器具及病人止血棉球及时进行消毒处理。防止锐器扎伤皮肤,一旦发生,应按临床外科要求,及时进行伤口清创。如直接沾染了临床诊断病例或确诊病例的血液,除及时消毒皮肤外,应口服强力霉素预防感染,服用剂量参照《人粒细胞无形体病诊疗方案(试行)》(附件1)。

(三)采集动物宿主与媒介蜱标本个人防护。

野外采集标本时,应穿着颜色明亮的防护服,并将衣袖或裤管口扎紧以防蜱叮咬人体,且容易发现蜱的附着。一旦发现有蜱附着体表,应用镊子夹取,不要用手直接摘除。野外作业或活动的人员可使用驱避剂或防蚊油喷涂皮肤,也可用硫化钾代替防蚊油。

(四)标本运输安全注意事项。

应参照《病原微生物实验室生物安全管理条例》中的有关要求(B类)进行。

(五)在诊疗及标本的采集、包装和实验室检测等过程中所产生的医疗废物,应按照《医疗废物管理条例》和《医疗卫生机构医疗废物管理办法》等相关规定处理。