手足口病（Hand-foot-mouth Disease, HFMD）是由多种人肠道病毒引起的一种儿童常见传染病，是我国法定报告管理的丙类传染病。大多数患者症状轻微，以发热和手、足、口腔等部位的皮疹或疱疹为主要症状。少数患者可出现无菌性脑膜炎、脑炎、急性弛缓性麻痹、神经源性肺水肿和心肌炎等，个别重症患儿病情进展快，可导致死亡。手足口病常出现暴发或流行，为指导各地做好手足口病的预防控制工作，制定本指南。

　　一、目的

　　（一）指导医疗机构、疾病预防控制机构开展疫情报告与监测。

　　（二）指导疾病预防控制机构开展流行病学调查、病原学监测。

　　（三）指导疾病预防控制机构、医疗机构开展重点场所及公众预防控制工作。

　　二、疾病概述

　　（一）病原学。

　　引起手足口病的病毒属于小RNA病毒科肠道病毒属，包括柯萨奇病毒A组（Coxasckievirus A, CVA）的 2、4、5、7、9、10、16 型等，B组（Coxasckievirus B, CVB)的1、2、3、4、5 型等；肠道病毒71型（Human Enterovirus 71, EV71）；埃可病毒（Echovirus, ECHO）等。其中以EV71及CVA16型较为常见。

　　肠道病毒适合在湿、热的环境下生存与传播，75%酒精和5%来苏不能将其灭活，对乙醚、去氯胆酸盐等不敏感；对紫外线和干燥敏感，各种氧化剂(高锰酸钾、漂白粉等)、甲醛、碘酒以及56℃30分钟可以灭活病毒。病毒在4℃可存活1年，-20℃可长期保存，在外环境中可长期存活。

　　（二）流行病学。

　　1．传染源。人是人肠道病毒的唯一宿主，患者和隐性感染者均为本病的传染源，隐性感染者难以鉴别和发现。发病前数天，感染者咽部与粪便就可检出病毒，通常以发病后一周内传染性最强。

　　2．传播途径。肠道病毒可经胃肠道（粪-口途径）传播，也可经呼吸道（飞沫、咳嗽、打喷嚏等）传播，亦可因接触患者口鼻分泌物、皮肤或粘膜疱疹液及被污染的手及物品等造成传播。尚不能明确是否可经水或食物传播。

　　3．易感性。人对人肠道病毒普遍易感。不同年龄组均可感染发病，以5岁及以下儿童为主，尤以3岁及以下儿童发病率最高。显性感染和隐性感染后均可获得特异性免疫力，产生的中和抗体可在体内存留较长时间，对同血清型病毒产生比较牢固的免疫力，但不同血清型间鲜有交叉免疫。

　　4．流行特征。该病流行无明显的地区性，全年均可发生，一般5-7月为发病高峰。托幼机构等易感人群集中单位可发生暴发。肠道病毒传染性强、隐性感染比例大、传播途径复杂、传播速度快，控制难度大，容易出现暴发和短时间内较大范围流行。

　　（三）临床表现。

　　手足口病潜伏期为2-10天，平均3-5天，病程一般为7-10天。

　　急性起病，发热，口腔粘膜出现散在疱疹，手、足和臀部出现斑丘疹、疱疹，疱疹周围可有炎性红晕，疱内液体较少。可伴有咳嗽、流涕、食欲不振等症状。部分患者无发热，仅表现为皮疹或疱疹。一般预后良好；少数病例，特别是EV71感染患儿，可出现脑膜炎、脑炎、脑脊髓炎、神经源性肺水肿、循环障碍等，病情凶险，可致死亡或留有后遗症。

　　（四）治疗原则。

　　目前无特异性治疗方法，以支持疗法为主，绝大多数患者可自愈。目前尚无特异性的疫苗。病例的治疗方法参考卫生部《手足口病诊疗指南（2008年版）》。

　　三、病例定义

　　（一）临床诊断病例。

　　在流行季节发病，常见于学龄前儿童，婴幼儿多见。

　　1．普通病例：发热伴手、足、口、臀部皮疹，部分病例可无发热。

　　2．重症病例：出现神经系统受累、呼吸及循环功能障碍等表现，实验室检查可有外周血白细胞增高、脑脊液异常、血糖增高，脑电图、脑脊髓磁共振、胸部X线、超声心动图检查可有异常。

　　极少数重症病例皮疹不典型，临床诊断困难，需结合实验室检测做出诊断。

　　若无皮疹，临床不宜诊断为手足口病。

　　（二）实验室确诊病例。

　　临床诊断病例符合下列条件之一者，即可诊断为实验室确诊病例：

　　1．自咽拭子或咽喉洗液、粪便或肛拭子、脑脊液、疱疹液、血清以及脑、肺、脾、淋巴结等组织标本中分离到人肠道病毒（指包括CVA16和EV71等有明确证据表明可以导致手足口病的人肠道病毒）。

　　2．自咽拭子或咽喉洗液、粪便或肛拭子等标本中检测到CVA16 或EV71特异性核酸，或从脑脊液、疱疹液、血清以及脑、肺、脾、淋巴结等组织标本等标本中检测到人肠道病毒（指包括CVA16和EV71等有明确证据表明可以导致手足口病的人肠道病毒）的特异性核酸。

　　3．血清标本人肠道病毒型特异性中和抗体滴度≥1∶256，或急性期与恢复期血清肠道病毒特异性中和抗体有4倍或4倍以上的升高。

　　（三）聚集性病例。

　　1周内，同一托幼机构或学校等集体单位发生5例及以上手足口病病例；或同一班级（或宿舍）发生2例及以上手足口病病例；或同一自然村发生3例及以上手足口病病例；或同一家庭发生2例及以上手足口病病例。

　　四、疾病监测

　　（一）疫情报告。

　　1．个案报告。各级各类医疗机构应按照《中华人民共和国传染病防治法》和《传染病信息报告管理规范》的有关规定，对符合病例定义的手足口病病例进行报告。

　　如为重症病例，请在“重症患者”处选择“是”；如为实验室诊断病例，请在“实验室结果”处选择相应的肠道病毒病原学分型信息。

　　实行网络直报的医疗机构应于24小时内进行网络直报，未实行网络直报的医疗机构应于24小时之内寄送出传染病报告卡。

　　2．聚集性病例报告。托幼机构和学校、医疗机构发现手足口病聚集性病例时，应以最快的方式向县（区）级疾病预防控制机构报告。

　　3. 突发公共卫生事件报告。局部地区或集体单位发生流行或暴发时，按照《突发公共卫生事件应急条例》、《全国突发公共卫生事件应急预案》、《突发公共卫生事件与传染病疫情监测信息报告管理办法》及有关规定，及时进行突发公共卫生事件信息报告。

　　（二）病原学监测。

　　各省区市卫生行政部门要组织医疗卫生机构开展病原学监测，了解病原动态分布变化。所有重症和死亡病例均需采样。此外，以县（区）为单位，每月最少需采集5例首次就诊的普通病例标本；当月县（区）病例总数少于5例时，全部采样。

　　以省（区、市）为单位,在手足口病流行年份中每年至少采集20对EV71 和10对CVA16感染的手足口病患儿的双份血清,以阐明和分析EV71和CVA16感染后IgG和IgM抗体的动态变化，评价血清学抗体试剂盒的敏感性和特异性。

　　以省（区、市）为单位，每月至少从手足口病病例中分离10株毒株并做血清型别鉴定，鉴定完成后并将毒株及鉴定结果于5个工作日内报送至中国疾病预防控制中心。具备测序条件的省份，可开展VP1基因序列测定和分析，进行基因定型，序列测定完成后将序列结果于5个工作日内报送至中国疾病预防控制中心；不具备测序条件者，将毒株送至中国疾病预防控制中心进行序列测定，中国疾病预防控制中心要于28个工作日内反馈基因定型结果。

　　所有病例的采样均由医疗机构完成，及时送至县（区）级疾病预防控制机构或指定的检测机构检测。检测机构将实验室检测结果于24小时内反馈给县（区）级疾病预防控制机构；县（区）级疾病预防控制机构接到结果后，于24小时内对检测病例的传染病报告卡信息进行订正，将其病例类型订正为“实验室诊断”，并在“实验室结果”处补填肠道病毒病原学分型信息。

　　各种标本采集和检测方法详见《手足口病标本采集及检测技术方案》（附件1）。

　　（三）监测信息分析与反馈。

　　各级疾病预防控制机构要每日对网络直报系统进行浏览，及时对报告的病例进行审核、查重、订正等工作，定期对监测数据进行分析，判断发病趋势，发现异常升高或病例呈聚集性分布或出现重症及死亡病例时，要及时核实并向同级卫生行政部门及上级疾病预防控制机构报告，并定期向下级疾病预防控制机构和医疗机构反馈疫情分析信息。

　　五、预防控制

　　（一）现场调查处置。

　　发现手足口病聚集性病例、重症或死亡时，县（区）级及以上疾病预防控制机构要立即组织开展现场调查处置。

　　1．流行病学调查。

　　（1）聚集性病例调查：了解聚集性病例的临床表现、流行特征，以分析流行因素，为采取防控措施提供依据。要对首发或指示病例开展流行病学调查，填写《手足口病个案调查表》（附件2）。

　　（2）重症或死亡病例调查：详细了解病例的基本信息、临床症状、发病就诊治疗过程、感染传播情况、病原检测结果，以分析重症及死亡病例的主要危险因素，填写《手足口病重症或死亡病例个案调查表》（附件3）。调查结束后，各省级疾病预防控制中心应将结果录入统一数据库，报送中国疾病预防控制中心。

　　（3）专题调查：根据当地手足口病疫情特点及流行特征，可开展专题调查，以了解当地的主要传播方式以及感染危险因素等，为制定干预措施提供依据。专题调查的方案及其内容，应根据调查目的专门设计。

　　（4）医疗机构要协助疾病预防控制机构对病例进行流行病学调查。

　　2．传染源的管理。

　　患儿应及时就医，并遵医嘱采取居家或住院方式进行治疗。居家患儿，家长或监护人应在社区（村）医生的指导下，密切关注患儿的病情变化，如发现神经系统、呼吸系统、循环系统等相关症状时，应立即送医院就诊，同时，要尽量避免与其他儿童接触。住院患儿应在指定区域内接受治疗，防止与其他患儿发生交叉感染。

　　管理时限为自患儿被发现起至症状消失后1周。

　　乡镇卫生院/社区卫生服务中心、村卫生室/社区卫生服务站等负责本辖区居家治疗的手足口病患儿的随访工作，掌握居家治疗患儿的病情进展情况。

　　3．标本采集和检测。

　　（1）所有重症和死亡病例均要采集标本，可以采集咽拭子、粪便或肛拭子、疱疹液、脑脊液、血清等，死亡病例还可采集脑、肺、肠淋巴结等组织标本。聚集性病例至少要采集2例病例标本开展病原学检测。

　　（2）医疗机构负责样本采集，疾病预防控制机构应指导医疗机构进行相关生物学标本的采集。

　　（3）疾病预防控制机构根据本地的技术能力，对采集的标本开展核酸检测、病毒分离；不具备技术条件时，及时送上级机构进行检测（附件1）。

　　4．消毒措施。

　　病家、托幼机构和小学的消毒应在当地疾病预防控制机构的指导下，由单位及时进行消毒，或由当地疾病预防控制机构负责对其进行消毒处理。医疗机构的消毒由医疗机构安排专人进行。消毒方法参见《消毒技术规范》（2002版）和《手足口病疫源地消毒指南》（附件4）。

　　5．健康教育。

　　各级医疗卫生机构应在政府领导下，与当地教育、宣传、广电等部门密切合作，充分利用12320公共卫生公益热线、广播、电视、报纸、网络、手机短信、宣传单/宣传画等多种方式，开展手足口病防治知识的宣传工作，使5岁以下儿童家长及托幼机构工作人员等了解手足口病的临床症状，掌握最基本的预防措施，强调保持良好的个人卫生习惯及环境卫生措施对于有效预防手足口病的重要性，动员托幼机构老师和管理人员、儿童家长成为手足口病防控工作的主动参与者，形成群防群控。与重症或死亡病例发病前1周或发病后有共同生活、居住史的5岁以下儿童，要对其家长或监护人进行健康教育，做好儿童的密切观察，出现症状要及时就诊和治疗。

　　（二）重点人群及重点机构的预防控制措施。

　　为降低人群手足口病的发病率，减少聚集性病例，避免医院感染，各地要做好以散居儿童为主的重点人群和以托幼机构、医疗机构为主的重点场所的预防控制工作。

　　1．散居儿童的预防控制措施。

　　（1）饭前便后、外出回家后要用肥皂或洗手液等给儿童洗手；看护人接触儿童前、替幼童更换尿布、处理粪便后均要洗手；

　　（2）婴幼儿的尿布要及时清洗、曝晒或消毒；注意保持家庭环境卫生，居室要经常通风，勤晒衣被；

　　（3）婴幼儿使用的奶瓶、奶嘴及儿童使用的餐具使用前后应充分清洗、消毒；不要让儿童喝生水、吃生冷食物；

　　（4）本病流行期间不宜带儿童到人群聚集、空气流通差的公共场所；避免接触患病儿童；

　　（5）儿童出现发热、出疹等相关症状要及时到医疗机构就诊；

　　（6）居家治疗的患儿避免与其他儿童接触，以减少交叉感染；父母要及时对患儿的衣物进行晾晒或消毒，对患儿粪便及时进行消毒处理。

　　2．托幼机构预防控制措施。

　　（1）每日进行晨检，发现可疑患儿时，要采取立即送诊、居家观察等措施；对患儿所用的物品要立即进行消毒处理；

　　（2）出现重症或死亡病例，或1周内同一班级出现2例及以上病例，建议病例所在班级停课10天；1周内累计出现10例及以上或3个班级分别出现2例及以上病例时，经风险评估后，可建议托幼机构停课10天；

　　（3）教育、指导儿童养成正确洗手等良好的卫生习惯；老师要保持良好的个人卫生状况；

　　（4）教室和宿舍等场所要保持良好通风；定期对玩具、儿童个人卫生用具（水杯、毛巾等）、餐具等物品进行清洗消毒；

　　（5）定期对活动室、寝室、教室、门把手、楼梯扶手、桌面等物体表面进行擦拭消毒；

　　（6）托幼机构应每日对厕所进行清扫、消毒，工作人员应戴手套，工作结束后应立即洗手；

　　（7）托幼机构应配合卫生部门采取手足口病防控措施。

　　3．医疗机构的预防控制措施。

　　（1）各级医疗机构应加强预检分诊，专辟诊室（台）接诊发热、出疹的病例。增加候诊及就诊等区域的清洁消毒频次，室内清扫时应采用湿式清洁方式；

　　（2）医务人员在诊疗、护理每一位病例后，均应认真洗手或对双手消毒，或更换使用一次性手套；

　　（3）诊疗、护理手足口病病例过程中所使用的非一次性仪器、体温计及其他物品等要及时消毒；

　　（4）对住院患儿使用过的病床及桌椅等设施和物品必须消毒后才能继续使用；

　　（5）患儿的呼吸道分泌物和粪便及其污染的物品要进行消毒处理。

　　附件：1．手足口病标本采集及检测技术方案

　　2．手足口病个案调查表

　　3．手足口病重症或死亡病例个案调查表

　　4．手足口病疫源地消毒指南

　　附件1

　　手足口病标本采集及检测技术方案

　　一、采集标本的种类、保存和运输

　　（一）粪便标本。

　　采集病人发病3日内的粪便标本，用于病原检测。粪便标本采集量5-8g/份，采集后立即放入无菌采便管内，外表贴上带有唯一识别号码的标签，4℃暂存12小时内送达实验室，-20℃以下低温冷冻保藏，需长期保存的标本存于-70℃冰箱。

　　（二）咽拭子标本。

　　采集病人发病3日内的咽拭子标本，用于病原检测。用专用采样棉签，适度用力拭抹咽后壁和两侧扁桃体部位，应避免触及舌部；迅速将棉签放入装有3-5ml保存液（含5%牛血清维持液或生理盐水，推荐使用维持液）的15ml外螺旋盖采样管中，在靠近顶端处折断棉签杆，旋紧管盖并密封，以防干燥，外表贴上带有唯一识别号码的标签。4℃暂存并在12小时内送达实验室，-20℃以下低温冷冻保藏，需长期保存的标本存于-70℃冰箱。

　　（三）血清标本。

　　各省（区、市）在手足口病流行年份中均应采集EV71 和CVA16感染的手足口病患儿的双份血清。采集急性期（发病0-7d）和恢复期（发病14-30d）双份配对血清用于阐明和分析EV71和CVA16感染后IgG和IgM抗体的动态变化，评价血清学抗体试剂盒的敏感性和特异性。静脉采集3-5ml全血，置于真空无菌采血管中，自凝后，分离血清，将血清移到2ml外螺旋的血清保存管中，外表贴上带有唯一识别号码的标签。将血清置于-20℃以下冰箱中冷冻保存。

　　（四）疱疹液。

　　在手足口病的实验室诊断中，从疱疹液中分离到病毒即可确诊该病毒为病因，可同时采集多个疱疹作为一份标本。先用75%的酒精对疱疹周围的皮肤进行消毒，然后用消毒针将疱疹挑破用棉签蘸取疱疹液，迅速将棉签放入内装有3-5ml保存液（含5%牛血清维持液或生理盐水，推荐使用维持液）的采样管中，在靠近顶端处折断棉签杆，旋紧管盖并密封，采样管外表贴上带有唯一识别号码的标签。所采集标本4℃暂存立即（12h内）送达实验室，－20℃以下低温冷冻保藏，需长期保存的标本存于－70℃冰箱。

　　（五）肛拭子标本。

　　采集病人发病3日内的肛拭子标本，用于病原检测。用专用采样棉签，从患儿肛门轻轻插入，适度用力弧型左右擦拭数下，拔出后,迅速将棉签放入装有3－5ml保存液（含5%牛血清细胞维持液）的15ml外螺旋的采样管中，采样管外表贴上带有唯一识别号码的标签。在靠近顶端处折断棉签杆，旋紧管盖，并密封，以防干燥。

　　（六）尸检标本。

　　采集脑、肺和肠淋巴结等重要组织标本，每一采集部位分别使用单独的消毒器械。每种组织应多部位取材，每部位应取2-3份约5-10g的组织，淋巴结2个，分别置于15ml-50ml无菌的有外螺旋盖的冻存管中，采样管外表贴上带有唯一识别号码的标签。

　　（七）脑脊液标本。

　　出现神经系统症状的病例，可采集脑脊液标本，进行病毒分离或核酸检测。采集时间为出现神经系统症状后3天内，采集量为1.0-2.0ml。采集后立即装入无菌带垫圈的冻存管中，4℃暂存立即(12h内)送达实验室，－20℃以下低温冷冻保藏，需长期保存的标本存于－70℃冰箱。但EV71感染神经系统时，很难在脑脊液中检测到EV71病原。

　　临床标本在运输和贮存过程中要避免反复冻融。标本采集后要全程冷藏或冷冻保存和运输，12小时内送达实验室。依照《人间传染的病原微生物名录》，肠道病毒或潜在含有肠道病毒的标本按B类包装，置于冷藏保存盒内运输，尽量缩短运输时间。可采用陆路或航空等多种运输方式，但在运输过程中应采取保护措施，避免强烈震动、重力挤压等现象。在送到省、地、市级CDC实验室时，包装盒内应带冰且包装完整。在上送标本的同时，需附带相关的《手足口病病例临床标本采样登记表》。

　　二、标本采集注意事项

　　在手足口病的实验室诊断中，从疱疹液或脑脊液中分离到病毒即可诊断该病毒为病因。用于采集咽拭子的无菌拭子要放在标本保存液中，如含5%牛血清维持液。用于分子生物学诊断的标本采集与病毒分离标本的采集方法一样。为了保证检测结果的准确性和有效性，标本应在病例发病后尽早采集，尽快检测。不能立即检测的标本应冷冻保存。对于血清学诊断，急性期血清应该在发病后尽早采集，恢复期血清在发病两周后采集。标本保存液的配置见下表：

　　 保存液

　　Eagle`s液(MEM) 80.5ml

　　3%L-谷氨酰胺200mM 1.0ml

　　胎牛血清 5.0ml

　　7.5%NaHCO3溶液 3.5ml

　　青、链霉素

　　（各10000U/ml） 10ml

　　三、实验室检测操作流程

　　（一）病毒分离。

　　1.试剂配置

　　（1）细胞的生长液、维持液的配制见下表：

　　 生长液（GM） 维持液（MM）

　　Eagle`s液(MEM) 86.5ml 92.5ml

　　3%L-谷氨酰胺200mM 1.0ml 1.0ml

　　胎牛血清 10.0ml 2.0ml

　　7.5%NaHCO3溶液 2.5ml 3.5ml

　　青、链霉素

　　（各10000U/ml） 1.0ml 1.0ml

　　（2）粪便标本和肛拭子的处理液

　　完全PBS液中加入P．S溶液，终浓度为青霉素100单位/ml，链霉素为100μg/ ml。

　　完全PBS液的配置：取以下1份B液和1份C液加到8份A液中即为完全PBS工作液。

　　A液：

　　试剂品名 加入量

　　NACL 8.00g

　　KCL 0.20g

　　Na2HPO4(无水) 0.91g

　　KH2PO4 0.12g

　　用600～800ml蒸馏水溶解以上盐类，加蒸馏水补至1000ml，10psi（70Kpa）15分钟高压灭菌，即为不完全PBS工作液（不含钙、镁离子）。

　　B液：

　　试剂品名 加入量

　　MgCl2.6H2O 0.10g

　　溶解于100ml蒸馏水中，10psi（70Kpa）15分钟高压灭菌。

　　C液：

　　试剂品名 加入量

　　CaCl2 0.10g

　　溶解于100ml蒸馏水中，10psi（70Kpa）15分钟高压灭菌。

　　2．病毒分离细胞系

　　许多细胞系可支持人肠道病毒（如EV71、CVA16）生长。

　　对于检测手足口病的病原来说，建议所有怀疑含EV71、CVA16等肠道病毒感染的标本均需接种到以下两种细胞系：

　　 RD细胞，来源于人横纹肌肉瘤细胞。

　　 HEp-2细胞，来源于人喉癌上皮细胞。

　　3．标本的处理

　　（1）粪便标本和肛拭子的处理

　　操作步骤：

　　1）在离心管上标记标本号；

　　2）每管中加入10ml PBS、1g玻璃珠、1ml氯仿；

　　3）在生物安全柜中将每一份粪便标本取大约2g加入标记好的离心管中（确保离心管上的标号与原始标本的标号一致）；肛拭子为2ml；

　　4）剩余的原始标本最好留在原容器中，冻存于－20℃；

　　5）确保拧紧离心管，用机械震荡器剧烈震荡20min；

　　6）在确保离心机的盖子盖好和离心桶密封的情况下，用冷冻离心机在1500g条件下离心20min；

　　7）在生物安全柜中将每1份标本的上清液分别吸入2个有外螺旋盖的冻存管中（如果上清液不清澈，应再用氯仿处理1次）；

　　8） 1管粪便悬液冻存于－20℃作为备份，另1管存于4-8℃以备接种。

　　（2）疱疹液标本的处理

　　疱疹液标本通常直接用于RNA提取或病毒分离。

　　（3）脑脊液标本的处理

　　脑脊液标本通常直接用于病毒分离。

　　（4）咽拭子标本的处理

　　咽拭子要在标本运输（保存）液中充分搅动（至少40下），以洗下拭子上粘附的病毒及含有病毒的细胞等，用于病毒分离时，需要冻融一次（防止多次冻融），使细胞破裂，释放病毒颗粒。然后在4℃条件下，10000 rpm离心20min，用上清接种到细胞上或直接提取RNA。如果发现有细菌污染，须用滤器过滤除菌。

　　4．接种和观察（病毒分离）

　　（1）通常使用８ml的斜面试管培养细胞，传细胞时，每管加细胞培养液1.5ml。显微镜下观察单层细胞，以确保细胞是健康、无污染的。一个健康的单层细胞会在传代后48小时左右形成；

　　（2）倒掉生长液（GM），换上1-1.2ml的维持液（MM）；

　　（3）每一份标本需要同时接种2支RD细胞和2支HEp-2细胞，正确标记每支细胞培养管（包括标本的编号、日期、传代数）；

　　（4）每一种细胞至少标记一管作为阴性对照；

　　（5）每支试管接种0.2ml的标本悬液，培养温度要求36℃。

　　（或者使用吸附的方法接种病毒：接种标本前，倒掉生长液（GM），每支试管接种0.2ml的标本悬液，培养温度为36℃；吸附1小时后，换上1.5ml的维持液（MM）。同样每份标本需同时接种2支RD细胞和2支HEp-2细胞。

　　（6）使用倒置显微镜每天观察细胞培养管，以观察有特征性的肠道病毒致细胞病变效应（CPE）的出现（如细胞变圆，折光增强并脱离管壁等）；

　　（7）记录接种管和对照管细胞所发生的变化至少一周，记录CPE（1+—4+）、提示细胞受毒性反应、老化或污染的影响而发生的变化（1+，<25%; 2+, 25%-50%; 3+, 50%-75%; 4+, 75%-100%）；

　　（8）如果有特征性的肠道病毒CPE出现，要如实记录，并观察直到75%的细胞发生变化（3+ CPE），然后储藏在－20℃以备二次传代；

　　（9）第一代培养见可疑细胞病变时应继续传代，待细胞病变稳定出现后－20℃或－70℃冻存；

　　（10）一代阳性分离物再传二代，如果又有明显的CPE出现，将病毒保存在－20℃冰箱（二代病毒）。因二代病毒滴度高于一代病毒，所以选用二代病毒进行鉴定；

　　（11）如果7d之后没有CPE出现，那么盲传1代继续观察7d。（注意：同一病例标本的细胞培养物不能混在一起再传代，例如：不同细胞的培养物应单独传代）；

　　（12）盲传两代后，仍然没有出现CPE的，则判定为阴性；

　　（13）注意：如果接种后24h内出现CPE，很可能是标本中的非特异性成分导致的毒性反应。取100μl阳性分离物传二代，继续观察；或者在接种标本吸咐1h后用维持液清洗细胞层，可能会降低毒性反应；

　　（14）几个概念：

　　A：毒性反应：如果在接种后1-2d内细胞快速凋亡，这可能是由于标本中含有毒性物质而导致的非特异性毒性反应。这些已接种标本的试管应在-20℃冻存，融化后取0.2ml接种到同一类型细胞中（此时是第二代）。如果又出现了毒性反应，那么应该取原始标本用PBS稀释10倍，再次接种到同种细胞中。这时应被认为是第一代。

　　B：微生物污染：由于细菌污染而造成培养液混浊或细胞死亡经常使病毒造成的CPE无法确定或根本无法出现。重新取原始标本，用氯仿或抗生素处理，按上述步骤重新接种到新鲜细胞上。

　　C：盲传：有时一周之后传代细胞会老化，甚至细胞对照也出现了病变。这时已接种标本的试管应在-20℃冻存，融化后取0.2ml接种到同一类型的新鲜单层细胞中，再观察7-10d。如果盲传两代后仍然没有产生CPE，那么认为这个标本是阴性的。

　　5．病毒分离结果解释

　　RD细胞支持HFMD的主要病原体——CVA16和EV71等多种肠道病毒的复制，CVA16和EV71均能在RD细胞培养中引起特殊的肠道病毒致细胞病变效应（CPE），表现为细胞圆缩、分散、胞浆内颗粒增加，最后细胞自管壁脱落。但相同滴度的CVA16和EV71在RD细胞中生长的速度不同，EV71的生长速度要快于CVA16，表现为EV71感染RD细胞后出现CPE的时间比CVA16早，EV71接种细胞后出现CPE很快，但CVA16一般要经过2次以上传代才出现明显的CPE。

　　若在使用RD细胞分离的同时再增加HEp-2细胞，可提高肠道病毒的分离率（分离出其他可能致HFMD的病原体，如一些柯萨奇B组病毒）。但CVA16和EV71在HEp-2细胞中均不繁殖。

　　（二）测定人双份血清标本的中和抗体滴度。

　　比较患者急性期血清与恢复期血清中和抗体滴度，可作为肠道病毒感染的血清学诊断方法，最常用的是中和实验，即用微量板法测定抗体滴度，是目前人肠道病毒抗体检测的最常用方法，该方法精确且具有型特异性。

　　作为肠道病毒感染的诊断方法之一，可以测定血清中肠道病毒中和抗体的滴度，通常用急性期血清与恢复期血清滴度进行比较，抗体滴度4倍或4倍以上增高证明病毒感染。但是，肠道病毒隐性感染也很常见，所以在评估检测结果时就要小心一些。在中和实验中，一般要用人肠道病毒参考毒株（即原型株，EV71原型株为BrCr株，CVA16原型株为G-10株）或流行株，有时同时（或单独）使用临床分离株会有助于得到更准确的检测结果。

　　使用对肠道病毒敏感的细胞，如RD细胞。用病毒（血清）稀释液（下面液体配制中的C液，可用维持液代替）稀释血清和制备病毒悬液，因为是用病毒来确定血清中抗体的滴度，所以要使用参考病毒（原型株），但有时使用所分离到的毒株（临床分离株）有助于得到更准确的检测结果，但分离株的滴度（100 CCID50/0.05ml）要事先测定。

　　中和实验的检测原理：病毒感染敏感靶细胞后，引起细胞形态学变化，出现CPE，特异性中和抗体与病毒结合后，可使病毒颗粒失去感染性，抑制CPE的出现。

　　1．液体配制

　　A液：血清处理液：（100ml中含下列试剂成份）

　　MEM 85ml

　　3% L-谷氨酰胺 1ml

　　7.5%碳酸氢钠 2ml

　　胎牛血清 2ml

　　青、链霉素（各10000U/ml） 10ml

　　B液：细胞营养液：（按生长液配方配制，100ml中含下列试剂成份）

　　MEM 85ml

　　3% L-谷氨酰胺 1ml

　　7.5%碳酸氢钠 2ml

　　HEPES 1ml

　　胎牛血清 10ml

　　青、链霉素（各10000U/ml） 1ml

　　C液：病毒（血清）稀释液：（按维持液配方配制，100ml中含下列液体）

　　MEM 93ml

　　3% L-谷氨酰胺 1ml

　　7.5%碳酸氢钠 2ml

　　HEPES 1ml

　　胎牛血清 2ml

　　青、链霉素（各10000U/ml） 1ml

　　2．攻击病毒CCID50滴定和滴度梯度制备

　　（1）将增殖后的病毒悬液冻融3次，然后在4℃、12000rpm条件下离心10min，取上清液分装于10支冻存管中，每管1.5ml，一般每管应在一次试验中用完，有剩余应高压后废弃；

　　（2）加Eagle液10倍系列稀释为10-1至10-8病毒液，各加入细胞板内，每孔50μl，每稀释度4孔细胞；

　　（3）每孔加细胞悬液50μl，同时设细胞对照（50μl稀释液+50μl细胞悬液）， 36℃培养7d，观察细胞病变；

　　（4）按Behrens-Kärber公式计算出分离病毒株的CCID50；

　　log CCID50 = L-d (S-0.5)，其中：

　　L = 实验中使用的最低稀释度的对数值；

　　d = 稀释梯度的对数值；

　　S = 终判时阳性部分的总和（即出现CPE的细胞孔所占的比例之和）。

　　（5）正式试验前应先滴定攻击病毒2-3次，取其平均值，求出每0.05ml中含100 CCID50的病毒载量；

　　（6）按照计算好的稀释比例配制攻击病毒，求出试验所需的病毒总量（即100 CCID50/0.05ml）；

　　（7）取3支小试管，每只加病毒稀释液（液体配制中的C液）0.9ml；

　　（8）用带滤芯的吸尖（ART吸尖）吸0.1ml已经稀释好的攻击病毒液（即100CCID50/0.05ml）到第一支小试管中，换另一支ART吸尖，轻轻并彻底地混匀，避免产生大量气溶胶，按照此方法依次稀释至1 CCID50/0.05ml和0.1 CCID50/0.05ml。

　　3．稀释血清

　　（1）发病1-3d内采取患者急性期血清，发病后2-4周采取恢复期血清，分别冻存在-20℃备检。

　　（2）取无菌小试管若干支（每份血清使用一支）置试管架上，每管加血清处理液（上面液体配制中的A液）0.3ml，加待测血清0.1ml，盖紧塞子，震摇混匀，放4℃冰箱过夜，即为1：4稀释血清。次日56℃、30min灭活。

　　（3）打开独立无菌包装48孔组织培养板，纵向使用，每孔加血清稀释液（上面液体配制中的C液）0.3ml，每份血清使用一排，每排4孔。使用移液器吸取处理过的血清0.1ml加入第一孔（即为1：16），吹吸8-10次，吸0.1ml加入第二孔（即为1：64），依次至1：1024，血清稀释的过程中不必更换吸尖。即每份血清标本进行4倍倍比稀释，即1：4、1：16、1：64、1：256、1：1024。

　　（4）每份血清标本的每个稀释度都要平行做两孔。

　　4．病毒中和抗体测定的操作步骤：

　　（1）取一块96孔板横向使用，每块板可以做8份（4对）待测血清，版面设计如下图所示。A1-A2孔（B1-B2、C1-C2、D1-D2、E1-E2、F1-F2、G1-G2、H1-H2）中每孔加入1:1024稀释度的待测血清0.05ml，不必更换吸尖，在A3-A4孔（B3-B4、C3-C4、D3-D4、E3-E4、F3-F4、G3-G4、H3-H4）中每孔加入1:256稀释度的待测血清0.05ml，A5-A6孔（B5-B6、C5-C6、D5-D6、E5-E6、F5-F6、G5-G6、H5-H6）中每孔加入1:64稀释度的待测血清0.05ml，A7-A8孔（B7-B8、C7-C8、D7-D8、E7-E8、F7-F8、G17-G8、H7-H8）中每孔加入1:16稀释度的待测血清0.05ml，A9-A10孔（B9-B10、C9-C10、D9-D10、E9-E10、F9-F10、G9-G10、H9-H10）中每孔加入1:4稀释度的待测血清0.05ml，A11-A12孔（B11-B12、C11-C12、D11-D12、E11-E12、F11-F12、G11-G12、H11-H12）为每份待测血清对照孔，每孔中补加稀释液0.05ml；

　　（2）上述孔中分别加入病毒0.05ml（病毒滴度事先已经稀释为100 CCID50/0.05ml）；

　　（3）盖好盖子后用微量板混匀器混匀，放入36℃ CO2孵箱中孵育2h；

　　（4）另取一块96孔板纵向使用，做100 CCID50/0.05ml病毒滴度的核实（每次实验都必须做）。每孔先加病毒稀释液（试剂配制中的C液）0.05ml，然后从0.1 CCID50/0.05ml加起，每孔0.05ml，每个稀释度8孔，不必更换吸尖，一直加至100 CCID50/0.05ml；同时留出4孔做为细胞对照孔，每孔加入0.1ml病毒稀释液，然后放入4℃冰箱中暂存；

　　（5）在孵育期间，用消化液消化细胞，准备细胞悬液，细胞悬液的浓度为2×105个/ml，每块96孔板至少需要准备10ml；

　　（6）孵育结束后每个待测血清孔、血清对照孔（待检标本板）和病毒回滴孔和细胞对照孔（病毒回滴板）分别加入0.1ml细胞悬液，然后用微量板混匀器混匀，放入36℃ CO2孵箱中孵育培养；

　　（7）使用倒置显微镜每天观察CPE，并记录病毒滴定结果，以不产生细胞病变的血清最高稀释度的倒数为终点效价。当100 CCID50/0.05ml的病毒对照孔出现完全病变时，判定最终结果（约5~7d）；

　　（8）注意：如果病毒对照结果（病毒回滴）不在32~320 CCID50/0.05ml的范围内，实验无效，就要重复实验。

　　5．结果判定

　　当最高稀释度血清的2孔中有1孔出现细胞病变，另一孔不出现细胞病变，该稀释度的倒数计即为该血清标本的中和抗体效价；当高稀释度2孔完全病变，相邻低稀释度2孔完全不病变，则两者平均稀释度的倒数即为该血清标本的中和抗体效价；当两个相邻稀释度血清均出现1孔细胞病变，另1孔不出现细胞病变，则两者平均稀释度的倒数即为该血清标本的中和抗体效价。

　　对于HFMD的双份血清中和实验结果来说，如果恢复期血清较急性期血清EV71或CVA16中和抗体滴度出现4倍或4倍以上增高即可确诊；如果恢复期血清较急性期血清其它肠道病毒中和抗体滴度出现4倍或4倍以上增高可证实该肠道病毒感染，是否为病因需要其它相关实验证实；如果单份血清中和抗体滴度大于1:256也有诊断意义，血清中和抗体滴度为1:128判定为可疑阳性。

　　（三）逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）。

　　1．RNA提取

　　可使用多种商业化试剂盒来提取RNA，针对临床标本应选择质量较高的“用于临床标本病毒RNA提取的试剂盒”，也可使用全自动RNA提取仪进行提取。针对病毒分离物，核酸提取比较容易，大部分商业化RNA提取试剂盒都可有效的提取到RNA。RNA提取依据使用的试剂不同，严格按说明书进行操作。

　　2．逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）

　　（1）引物序列合成

　　国家脊灰实验室自行设计3对引物，分别为人肠道病毒通用引物、EV71特异性引物和CVA16特异性引物。各省CDC依据引物序列在质量有保证的公司合成,引物合成后,需要做预实验，保证引物合成没有质量问题后,分发给地市级CDC。

　　1）人肠道病毒（包括EV71、CVA16）核酸检测通用引物序列：

　　PE2（上游）：5`- TCC GGC CCC TGA ATG CGG CTA ATC C -3`

　　PE1（下游）：5`- ACA CGG ACA CCC AAA GTA GTC GGT CC -3`

　　2）EV71核酸检测引物序列：

　　EV71-S（上游）：5`- GCA GCC CAA AAG AAC TTC AC -3`

　　EV71-A（下游）：5`- ATT TCA GCA GCT TGG AGT GC -3`

　　3）CVA16核酸检测引物序列：

　　CVA16-S（上游）：5`-ATT GGT GCT CCC ACT ACA GC-3`

　　CVA16-A（下游）；5`-TCA GTG TTG GCA GCT GTA GG-3`

　　（2）实验设计

　　1）在PCR记录纸（实验记录纸）上记录本次实验操作者姓名，实验日期，所鉴定标本的名称以及标本的顺序，与PCR仪排列的顺序一致。

　　2）标记好加标本和对照的PCR管（阳性对照，阴性对照和试剂对照）。

　　A：阳性对照：参比RNA，省级CDC提供（只是在初次使用，常规不建议使用，以防污染）。

　　B：阴性对照：使用正常细胞RNA或临床标本肠道病毒阴性的RNA（每次实验要设立）。

　　C：试剂对照：用去离子水代替标本（试剂初次使用时必须做）。

　　（3）RT-PCR扩增反应和条件

　　1）从临床标本或病毒中提取的RNA和各种RT-PCR试剂应该一直放在冰浴盒上；

　　2）配下列试剂主溶液：

　　10×PCR Buffer•••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••5.0μl

　　dNTPs（2.5mM each）•••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••2.0μl

　　上游引物（0.1μg/μl）•••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••1.0μl

　　下游引物（0.1μg/μl）•••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••1.0μl

　　RNA酶抑制剂（RNasin,40U/μl）••••••••••••••••••••••••••••••••••••••0.5μl

　　Taq DNA聚合酶（5U/μl）•••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••0.5μl

　　AMV逆转录酶（10U/μl）••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••1.0μl

　　模板RNA••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••3.0μl

　　RNase Free dH2O•••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••36.0μl

　　 50.0μl

　　3）在PCR仪上进行RT-PCR反应，反应步骤如下：

　　42℃••••••••••••••••••••••••45min

　　95℃••••••••••••••••••••••••3min

　　95℃••••••••••••••••••••••••20s

　　45℃••••••••••••••••••••••••25s ×32个循环

　　72℃••••••••••••••••••••••••30s

　　72℃••••••••••••••••••••••••10min

　　4℃••••••••••••••••••••••••Soak

　　3．电泳分析

　　（1）将已经聚合的3%的琼脂糖凝胶放在电泳装置上；

　　（2）在帕拉膜（Parafilm）上加上6 × 电泳载样缓冲液（每个反应需1μl）。再加上5μl的PCR反应产物与之混合；

　　（3）将电泳缓冲液倒在电泳装置中，用吸尖将样品与载样缓冲液的混合溶液加到孔中；

　　（4）盖上盖子，接通电源，以10V/cm电压（恒定电压）电泳，大约35-40min，直到溴酚蓝跑到凝胶的底部的时候，停止电泳；

　　（5）将胶取出，并注意保持凝胶的方向；

　　（6）在1μg/ml的溴化乙锭溶液中染色15min，

　　注意：溴化乙锭溶液是有毒、致畸、并且致肿瘤的物质，操作时要加小心，并戴双层手套。如果储存在避光的容器中，溴化乙锭溶液可以重复使用。溴化乙锭废弃物按医疗废弃物中化学品的有关规定处理。

　　（7）在蒸馏水中涮一下凝胶；

　　（8）在紫外透射仪下观察PCR产物电泳结果，并照相作记录。

　　有条件的实验室可以使用全自动电泳分析仪。

　　4．结果解释

　　使用全自动电泳分析仪的实验室可以通过仪器自动读取PCR产物大小，来判断结果。通过琼脂糖凝胶做PCR产物电泳的实验室，需要参照DNA分子量对照对照，比较标本的PCR产物与阳性对照的PCR产物在凝胶上的位置以及大小来解释结果。

　　RT-PCR实验结果解释表

　　待检标本RT-PCR结果 鉴定结果

　　HEV(-), EV71(-), CVA16(-) 非肠道病毒（NEV）

　　HEV(+), EV71(-), CVA16(-) 非EV71、CVA16的其它肠道病毒

　　HEV(+), EV71(+), CVA16(-) EV71

　　HEV(+), EV71(-), CVA16(+) CVA16

　　(四) Real-time RT-PCR （rRT-PCR）

　　1. 病毒核酸提取

　　参考常规RT-PCR病毒核酸提取步骤和注意事项。

　　2. Real-time RT-PCR （rRT-PCR）

　　依据不同厂家的试剂盒，严格按相应说明书操作和判断结果。有5种试剂盒，分别为One Step Real-time PCR法检测EV71病毒核酸（单通道检测）；One Step Real-time PCR法检测CVA16核酸（单通道检测）；One Step Real-time PCR法检测肠道病毒核酸（单通道检测）；One Step Real-time PCR法同时检测EV71和CVA16核酸（双通道检测）；One Step Real-time PCR法同时检测EV71和肠道病毒核酸（双通道检测）。下面举2个例子来说明单通道检测和双通道检测的操作规程和注意事项。

　　（1） One Step Real-time PCR法检测EV71病毒核酸（单通道检测）

　　①反应体系配置：反应体系共25μl，模板量可根据样本情况自行决定（临床标本通常使用5μl的RNA模板量），不够部分以水补足。如选用另外试剂盒，反应体系及条件随之变化。

　　a.从试剂盒中取出相应的试剂，反应液在室温融化后，瞬时离心，按n+1配置反应体系（n=样本数+1管阳性对照+1管阴性对照），每个测量反应体系配置如下表：

　　试剂组成 1份样品的量

　　荧光RT-PCR反应液 12.5μl

　　逆转录酶 0.5μl

　　Taq酶 0.5μl

　　引物和探针 1.5μl

　　H2O 5μl

　　b.将上述反应液混匀离心后，按照每管20μL分装于各荧光PCR仪适用的PCR管中。

　　c.加样：将提取好的样本RNA，分别加入上述分装好的PCR反应管中，模板量可根据样本情况自行决定（临床标本通常使用5ul模板量），不够部分以水补足。总反应体积25μL。

　　②荧光RT-PCR循环条件设置

　　程序 循环数 温度（摄氏度） 反应时间（分钟：秒）

　　1 1 42℃ 30min

　　2 1 95℃ 2min

　　3 40 95℃ 10sec

　　 60℃ 35sec

　　 60℃时收集荧光信号

　　③对照设置

　　阴性对照：核酸提取时以灭菌双蒸水代替标本，每次实验应设立。

　　阳性对照：由省级实验室提供EV71阳性核酸（只在评价试剂时使用）

　　④结果分析条件设定和结果判断

　　阈值设定

　　原则以阈值线刚好超过正常阴性对照扩增曲线的最高点，结果显示阴性为准，或可根据仪器噪音情况进行调整。

　　Ct值≤35.0的样本为阳性。

　　38.0> Ct值>35.0的样本为临界值。

　　Ct值≥38.0的样本或无数值的标本为阴性。

　　（2） One Step Real-time PCR法同时检测EV71和CVA16核酸（双通道检测）

　　双通道可以同时检测EV71和CVA16核酸,在提取核酸后短时间(2.5小时)内检测到标本中是否含EV71或CVA16核酸。

　　①反应体系配置

　　反应体系共25μl，模板量可根据样本情况自行决定（临床标本通常使用5μl模板量），不够部分以水补足。如选用另外试剂盒，反应体系及条件随之变化。

　　a.先将试剂解冻，从试剂盒中取出相应的试剂，反应液在室温融化后，瞬时离心，按n+1配置25μl反应体系（n=样本数+1管阳性对照+1管阴性对照），每个测量反应体系配置如下表：

　　b.将下述反应液混匀离心后，按照每管20μL分装于适用的PCR管中。

　　试剂组成 1份样品的量

　　荧光RT-PCR反应液 12.5μl

　　逆转录酶 0.5μl

　　Taq酶 0.5μl

　　引物和探针 3μl

　　H2O 3.5μl

　　c.加样：将提取好的样本RNA，分别加入上述分装好的PCR反应管中，模板量可根据样本情况自行决定（临床标本通常使用5ul模板量），不够部分以水补足。总反应体积25μL。

　　②荧光RT-PCR循环条件设置

　　程序 循环数 温度（摄氏度） 反应时间

　　1 1 42℃ 30 min

　　2 1 95℃ 2 min

　　3 40 95℃ 10 s

　　 60℃ 35 s

　　 60℃时收集荧光信号

　　③结果分析条件设定和结果判断

　　阴性对照：核酸提取时以灭菌双蒸水代替标本。

　　阳性对照：提取好的阳性核酸作为模板RNA。

　　阈值设定原则以阈值线刚好超过正常阴性对照扩增曲线的最高点，结果显示阴性为准，或可根据仪器噪音情况进行调整。

　　Ct值≤35.0的样本为阳性。

　　Ct值无数值的标本和Ct值≥38.0的样本为阴性样本。

　　38.0> Ct值>35.0的样本为临界值。

　　注：荧光PCR同时读取FAM和HEX，进行双通道检测，FAM荧光Ct值为CVA16的结果，HEX荧光 Ct值为EV71的结果。

　　四、生物安全

　　根据2006年1月11日卫生部制定的《人间传染的病原微生物名录》，柯萨奇病毒、埃可病毒、EV71型和目前分类未定的其他肠道病毒均属于危害程度第三类的病原微生物。因此在保证安全的前提下，对临床和现场的未知样本检测操作可在生物安全II级或以上防护级别的实验室进行，涉及病毒分离培养的操作，应加强个体防护和环境保护。

　　操作粪便、脑脊液和血液等临床标本时要特别注意生物安全，要在II级生物安全柜中进行标本处理、病毒分离和病毒鉴定，无脊灰疫苗免疫史的人员要进行脊灰疫苗免疫。

　　灭活后的血清抗体检测与PCR检测可在生物安全I级实验室进行。

　　所有操作应遵守国家相关法律法规。